زراعة الانسجة

زراعة الخلايا والأنسجة النباتية
تاريخ زراعة الأنسجة:
يعتبر علم زراعة الأنسجة والأنسجة النباتية واحد من أهم اكتشافات وفوائد العلم الحديث ويرجع تاريخ زراعة الخلايا الى بداية القرن العشرين عندما قام العالم Haberlandt 1902 بنشر نتائج محاولة لزراعة خلايا نباتية مفردة إلا أنه لم ينجح في ذلك ، ثم تمكن العالم Herning (1904) من الحصول على مزارع أنسجة أنسجة لقمم الجذور النباتية ثم تطورت الأبحاث شيء فشيئاً حتى توصل العالمبان Miller & Skoag 1957 أن نسبة الأكسين والسانيوكينين في الوسط الغذائي تلعب دوراً هاماً في تحديد طبيعة نمو وتخصص الجزء النباتي المزروع في ذلك الوسط ثم استطاع Murachign & Skoog 1962 من احداث طفرة علمية في مجال تطوير تقنية زراعة الأنسجة والانسجة النباتية حيث توصل الى تركيب بيئة غذائي لزراعة أنسجة نبات الدخان والتي اصبحت فيما بعد من أشهر البيئات حتى يومنا هذا حيث يرمز لها بالرمز (MS) وشهدت السنوات الثلاثة الماضية تطوراً وتقدماً كبيراً في مجال تقنية زراعة الأنسجة والخلايا النباتية بغرض الاكثار.
ماذا نعني بزراعة الخلايا:
وهو استخدام خلايا أو نسيج من أعضاء نباتية للحصول على نباتات جديدة وبأعداد كبيرة في زمن أقل من الاكثار بالطرق التقليدية. حيث يتم زراعة هذه الخلايا أو الأنسجة النباتية على بيئة غذائية تحتوي على تركيزات متوازنة من العناصر المعدنية الكبرى والصغرى. والسكروز (كمصدر للكربون) وبعض منظمات النمو والفيتامينات مع توفر جميع الظروف للبيئة الملائمة مثل الضوء ، الحرارة وغيرها. وتتم عملية الزراعة في أواني زجاجية أو بلاستيكية وتكون جميع خطوات العمل تحت ظروف معقمة تماما.وتتم حفظ هذه المزارع في حضانات يتم فيها توفير التحكم في الظروف البيئية الملائمة لكل نوع نباتي.
مميزات استخدام تقنية زراعة الأنسجة:
1- صغر حجم الجزء النباتي المستخدم للاكثار .
2- تتم في حيز مكاني صغير نسبيا يمكن التحكم فيه.
3- تتم تحت ظروف معقمة تماما وبعيد عن كل الملوثات والكائنات الحية الضارة من بكتريا وفطريات وفيروسات.
4- امكانية استخدامها على مدار العام حيث لا ترتبط بالتسلسل الطبيعي لدورة حياة النبات ونموه.
5- تجنب تدهور النبات كما في الاكثار الخضري.
6- يمكن نقل الوحدات الى أماكن بعيدة .
7- سهولة اكثار بعض النبات الصعب الاكثار بالطرق التقليدية.

التطبيقات العلمية والعملية لتقنية زراعة الخلايا:
1- الاكثار السريع للأصناف الجديدة أو ذات مواصفات خاصة:
حيث يمكن انتاج نباتات في وقت قصير إذا ما قورنت بالطرق التقليدية حيث تستغرق وقت طويل ومن ثم عدم نجاحها بصورة طبيعية. وبهذه الطريقة يمكن اكثارها بشكل سريع وكثيف في وقت قصير ومن أهم المحاصيل : البطاطا ، الثوم ، البطاطس ، الاسبرجس ، الفراولة.
2- انتاج نباتات خالية من الفيروسات: حيث يتم زراعة القمم المرستيمية ويمكن انتاج نباتات مثل الفراولة ،
3- انتاج نباتات بنصف العدد الكروموسومي (Haploid)
تعتبر هذه التقنية مهمة في تركيب وتحسين النباتات طالما أمكن ملاحظة الطفرات الوراثية الممكن حدوثها وتشخيصها في فترة زمنية قصيرة ويمكن مضاعفة العدد الكروموسومي للنباتات الناتجة يعني الحصول على نباتات نقية 100% من حيث الصفات الوراثية للنبات الام homozygous (تتم في هذه الطريقة زراعة المتوك وحبوب اللقاح .(anther and pollen culture)
4- الحصول على تغيرات وراثية مرغوبة.
5- دراسة بعض الحقائق الهامه مثل قدرة الخلية النباتية على تخليق فرد جديد كامل وذلك باحتواء الخلية على كامل الصفات الوراثية.
6- دراسة نمو وتطور الأجزاء النباتية المختلفة بعيداً عن النبات الكامل بدون حدوث أي تأثير عن العوامل أو المؤثرات الخارجية.
7- المحافظة على التراكيب الوراثية germplasm عن طريق تحسين الخلايا أو القمم النباتية.
8- امكانية نقل الأصول الوراثية لأي نبات او لأي مجموعة من النباتات من مكان لآخر في سهولة.
9- دراسة الهندسة الوراثية.

بعض المصطلحات الخاصة بتقنية زراعة الخلايا:
In Vitro: كلمة لاتينية يقصد بها التجارب المعملية على الأعضاء النباتية في الأوعية الزجاجية تحت ظروف صناعية Artificial condition. لزراعة الخلايا والأنسجة.
In Vivo: كلمة لاتينية يقصد بها التجارب المعملية على الأعضاء النباتية وهي مازالت مرتبطة بأجزاء النبات الأم وذلك تحت الظروف الطبيعية.
Excise: هو عزل أو فصل أنسجة أو أعضاء من النبات الأم كأجزاء نباتية للزراعة بطريقة جراحية وزراعتها في أوعية زجاجية In Vitro.
Shoot apex or Shoot Tip: وهي القمم المرستيمية الهرمية أو قبية الشكل merstemic dome وأيضاً مبادئ خروج الأوراق Leaf primordial والاوراق المتكشفة Emerging Leaves وبعض من خلايا استطالة الساق.
Meristem: هو منطقة النمو والانقسام وتكوين وبناء البروتوبلاست ومنشأ الأنسجة الجديدة في النبات. وعادة تكون هذه الخلايا غير متميزة ومنها تتكون الأنسجة التخصصية وظيفيا وفسيولوجياً ، وتوجد المرستيمات في القمم النامية للأفرع الخضرية أو الجذور أو الأوراق وخلايا الكمبيوم وأماكن النمو الأخرى مثل الأوراق الحديثة.
Bud: وهي عبارة البرعم الخضري أو الزهري ومازال في حالة نشوء ولم يتكشف بعد وعادة ما يكون مغلف بعدة أوراق حرشفية تسمى Bad Scale.
Axillary’s bud: هو عبارة عن برعم أو فرع خضري او ابطي ويتكون عادة من الخلايا المرستيمية الابطية للقمم النامية وعادة يدفع لانتاج أعداد كبيرة ويتم ذلك من خلال استخدام الهرمونات النباتيه التي تعمل على تثبيط السيادة القمية وتشجيع انتاج الأفرع الجانبية Lateral Shoot.
Callus: وهي خلايا غير منكشفة وتتكون من الأجزاء المجروحة المنفصلات النباتية (explant) وهي عبارة عن خلايا برنشيمية تختلف في درجة تلجننها وعادة لا يوجد بينها مادة لاحمة Middle lamela.

أنواع مزارع الخلايا والأنسجة النباتية:
1- زراعة النبات Plant culture هو زراعة البادرات والنباتات الكاملة.
2- زراعة الأعضاء النباتية :Organs Culture وهي أعضاء من نبات الام امكن فصلها وتشمل القمم الأفرع الخضرية ـ الجذرية ، مبادئ الاوراق، الأزهار والثمار غير مكتملة النمو. وأهم ما يميز زراعة الأعضاء هو الاحتفاظ بصفاتها الإنتاجية واستمرارها في النمو بنفس الوضع كما لو كانت متصلة بالنبات الأم.
3- زراعة الكالس Callus Culture وهو زراعة الخلايا الغير متكشفة والتي تكونت على الأجزاء المجروحه للمفصلات النباتية (explant) وتنمو أنسجة الكالس والتي تعتبر كتلة من الخلايا على بيئات صلبة.
4- زراعة الأجنة Embryo culture : حيث يتم زراعة الأجنة مفصولة سواء اجنة مكتملة أو غير مكتكلة النمو .
5- زراعة المتك وحبوب اللقاح Anther culture: يتم زراعة المتك كاملة مع حبوب اللقاح أو زراعة حبوب اللقاح أو زراعة حبوب اللقاح فقط ويتم ذلك بفصل البراعم الزهرية ثم تعقيم وتفصل المتوك وتنقل إلى بيئة غذائية مناسبة ويجب أن تكون المتك ناضجة ومكتملة النمو.
6- زراعة المبيض Ovals Culture : وهو زراعة العضو التأنيثي الزهري للنبات.

بيئات الزراعة المستخدمة في تقنية زراعة الخلايا والأنسجة النباتية Culture media :
تعتبر بيئة زراعة الأنسجة الأنسجة ومكوناتها من أهم العوامل المؤثرة في نجاح زراعة الخلايا نظرا لتأثيرها على الجزء النباتي المفصول (Explant) وعلى طبيعة نموه وانقسامه وتخصصه. والبيئة الزراعية هي عبارة عن الوسط الغذائي الذي يستخدم في مجال زراعه الخلايا حيث ينمو عليها الجزء النباتي والذي يستخدم لهدف معين ومحدود مثل الكالس أو الاستمرار حتى تحدث عمليات تكشف وانقسام للحصول على النموات الخضرية أو الجذرية أو الحصول على نمو كامل وتختلف البيئة المستخدمة تبعاً لكل نوع نباتي والجزء المفصول وكذلك لكل غرض.
مكونات البيئة الزراعية:
1- الأملاح المعدنية Mineral Salt (عناصر كبرى ،عناصر صغرى) مثل N, P, Mg, S. Fe.
2- الفيتامينات Vitamins تضاف بكميات قليلة مثل فيتامين B1 ، الريبوفلافين B2 بيوتين B2 النياسين ، حمض الاسكوربيك V.C.
3- مصدر الكربون (السكريات) Carbon Source : مثل السكروز ، الفركتوز ، الجلوكوز.
4- الأحماض الأمينية: Amino acids : مثل جلوكامين ، اسباراجين ، ليسين ، ألانين.
5- منظمات النمو Growth regulator : حيث تعتبر من أهم المركبات لما لها من تأثير على عمليات انقسام الخلايا وتكشف الأعضاء النباتية ومن أهمها: الأوكسينات، الجبريلينات ، السيتوكينات.
6- مركبات أخرى Other compound
7- : مثل لبن جوز الهند ، الفحم النباتي النشط ، الأجار ، مستخلص الخميرة والشعير.

3 - مجالات زراعة الأنسجة والخلايا
توجد أربعة مجالات رئيسية لزراعة الأنسجة والخلايا نجملها فى المجالات التالية:
1- إنتاج بعض المواد الكيماوية العلاجية والمواد الطبيعية.
2- التحسين الوراثى للمحاصيل.
3- الحصول على سلالات خالية من الأمراض.
4- استخدام زراعة الأنسجة كوسيلة سريعة للتكاثر وإنتاج غزير من النباتات.

أولاً: إنتاج المواد الكيماوية الطبية والمواد الطبيعية Production of pharmaceutical and other natural products
كما هو معروف فإن هناك عديد من النباتات التى تنتج مواد طبيعية تعتبر إحدى نواتج عمليات التمثيل الغذائى يقوم الإنسان باستخراجها واستعمالها فى صناعات عديدة أهمها صناعة الدواء وإنتاج الزيوت العطرية ومكسبات النكهة والطعم. والأمثلة على ذلك عديدة نجملها فى الجدول التالى :

جدول (1) يوضح أهم المركبات الفعالة التى تستخرج من النياتات الطبية والعطرية بزراعة الأنسجة
المادة اسم النبات المستخرجة منه
1- القلويدات
- أتروبين الأتروبا Atropa belladonna
- أفيدرين Ephedra Vulgaris
- لينين Cinchona spp.
- كوكايين نبات الكولا Erythroxylon coca
-هيوسيامين السكران Hyscyamus spp.
- ستريكتين الجوز المقئ Strychnase sp.
- كافين البن Coffea Arabica
2- الجلوكسيدات
- الأميجدالين نوى الخوخ والمشمش والبرقوق .
- السالسين الصفصاف .
- زيت المستطردة نباتات الفصيلة الصليبية .
3 - الزيوت العطرية عديد من النباتات
4- الفيتامينات عديد من النباتات


ولقد أمكن استخدام زراعة الأنسجة لبعض النباتات الطبية مثل الداتورة والسكران والديجتالس لإنتاج المواد الطبية وكذلك بعض النباتات العطرية مثل الريحان والنعناع والعتر لإنتاج الزيوت العطرية وذلك بزراعة أنسجة أو أعضاء مختلفة من تلك النباتات للحصول على نسيج الكلس ثم يستخلص المادة الفعالة منه دون الحاجة لزراعة النبات بأكمله وبذلك يمكن توفير مساحات الأراضى اللازمة لزراعة هذه النباتات وكذلك توفير المجهود الزراعى وكذلك المجهود اللازم لاستخراج هذه المواد من النبات الكامل وربما يكون ذلك التكنيك من الناحية الاقتصادية أكثر نفعاً . ويعتبر هذا المجال من مجالات زراعة الأنسجة الحديثة التى لم تطرق بعد بالقدر الكافى لأنه من المتوقع أن يكون من أهم المجالات لاستخدام زراعة الأنسجة فى المستقبل القريب.
أعلى الصفحة

ثانياً: التحسين الوراثى للمحاصيل The genetic improvement of crops :
يخدم تكنيك زراعة الأنسجة والأعضاء والخلايا مربى النبات فى مجالات مختلفة نجمعها فى الآتى:

Embryo development- - Embryo & Ovary culture
- Induction and isolation of mutation.
- Source of variation . - Cell & tissue culture
- Haploid plants development - Anther & microspore
- Mutation
- Hybridization
- Gene transfer - Protoplasts


أن البحث عن التراكيب الوراثية أو مصادر الاختلافات الوراثية وإنتاج أصناف جديدة لهو الشغل الشاغل لمربى النبات وهو فى صدد هذا الهدف قد يواجه بعدة عقبات يمكن تزليلها بتكنيك زراعة الأنسجة والأعضاء.
1- ثبت أن الأجنة الناتجة من الهجن المتباعدة الآباء لا يتم تكوينها ونضجها مثل الأجنة الناتجة عن الهجن الجنسية والنوعية، تلك الأجنة تعانى من ظاهرة تعرف بظاهرة العقم الأندوسبيرمى Somatoplastic sterility وتنتج من عدم التوازن الكروموسومى لأنسجة الإندوسبرم والجنين فكما هو معروف أن الأجنة لا تتصل مباشرة بالأنسجة الوعائية لنبات الأم ولكن يتم الاتصال عن طريق الإندوسبرم والذى يستقبل المواد الغذائية ثم يقوم بتوصيلها للجنين عن طريق الحيل السرى . وبالفحص السيتولوجى لمثل تلك الأجنة الهجينة ثبت أن الزيجوت ينقسم عدة انقسامات أولية كالمعتاد ثم يتكون فى قاعدة البويضة أى بين الحبل السرى والطرف الكلازى منطقة بها خلايا غير حية تمنع من وصول الغذاء للأندوسبرم وعندئذ يموت نسيج الإندوسبرم والذى يعقبه موت الجنين فإذا أمكن عزل الأجنة الجنسية فى وقت مناسب وتنميتها على بيئة مناسبة فإنه يمكننا الحصول على تلك الأجنة فيما يعرف بزراعة الاجنة Embryo culture وهو هدف عظيم لمربى النبات .
2- عند سعى مربى النبات فى الحصول على قوة الهجين يواجه بعدة مشاكل أهمها طول القترة بين الأجيال والتى تطيل من برامجه فضلاً على صعوبة الحصول على نباتات متماثلة فى صفاتها الوراثية Homozyous لذلك يتطلب منه تأصيل العوامل الوراثية بالتربية الذاتية أو التهجين الذاتى لعدة أجيال فيواجه بأن نباتات الجيل الثالث أوالرابع تكون عديمة الخصوبة مما يوقف من برامجه لذلك فإن حصوله على نبات أحادى المجموعة الكروموسومية Haploid يعتبر من الآمال العظيمة لمربى النبات حيث يمكنه مضاعفتها بالكولشيسين فيحصل على نبات ثنائى المجموعة الكروموسومية وفى نفس الوقت أصيل فى عوامله الوراثية Homozygous وذلك باستخدام مجال زراعة الأنسجة بزراعة المتك أو حبة اللقاح لإنتاج نبات أحادى المجموعة الكروموسومية وفى وقت قصير جداً بالمقارنة بالطريقة التقليدية .
3- من أهم طرق التربية هو البحث عن تراكيب وراثية عن طريق الانتخاب لذلك تصعب تلك المهمة على مربى النبات إذا تضاءلت أمامه وجود مصادر الاختلافات الوراثية أما إن توافرت فيكون أمامه مهمة صعبة وهى عمل Screening لعدد كبير من النباتات وهى مهمة ولكن باستخدام تكنيك زراعة الأنسجة ومعلقات الخلايا يمكن لمربى النبات معملياً أن يتعامل مع عشيرة كبيرة جداً فى فى طبق بترى فيسهل عليه مهمة الانتخاب إذ أن الانتخاب سوف يجرى على مستوى الخلية وليس على مستوى النبات الكامل وفى هذا المجال يمكن لمربى النبات أن ينتخب لصفات عديدة مقل مقاومة الأمراض ، مقاومة الملوحة ، مقاومة سُمية المبيدات ، مقاومة النيماتودا ، مقاومة الجفاف .. الخ. ويتم ذلك بالحصول على مزارع للخلايا ثم تعامل بسموم الفطر المسبب للمرض أو بتركيزات عالية من الملح أو بتركيزات مختلفة للمبيد ثم تنتخب الخلايا التى تقاوم الصفة المرغوبة فتنتقل إلى بيئة غذائية لتكوين الكلس ثم يوجه الكلس نحو تخليق الأعضاء الخضرية والجذرية وبذلك يمكن الحصول على نبات كامل كما يمكن بنفس التكنيك استحداث الطفرات وعزلها .
4- قد يصعب على مربى النبات إجراء التهجينات الجنسية والنوعية عند الرغبة فى نقل صفة ما من نبات إلى آخر لكن عن طريق التكنيك الجديد وهو ما يعرف بتكنيك الهندسة الوراثية وزراعة البروتوبلاست يمكن إجراء تلك التهجينات فضلاً على إمكانية عزل جين بمفرده ونقله ليدمج مع المادة الوراثية لنبات مراد إدخال صفة ما فيه بالإضافة إلى إمكان نقل أى مادة وراثية معزولة من أى كائن حى إلى النبات وقد كان وذلك بالطبع مستحيل باستخدام الطرق التقليدية.
أعلى الصفحة

ثالثاً : الحصول على سلالات خالية من الأمراض Pathogen free plants :
تصاب كثير من النباتات بالأمراض الفيروسية ويبذل الدارسون جهداً كبيراً للحصول على نباتات خالية من الإصابة ويستخدم تكنيك زراعة الأنسجة فى الحصول على تلك النباتات بطرق عدة:
1- زراعة القمم النامية حيث وجد أن الفيرس ينتقل بصعوبة وبطء إلى قمم النباتات وبالتالى فهى غالباً ما تكون خالية من الفيرس خاصة إذ عزلت بأحجام ميكروسكوبية تصل إلى 0.2 – 0.5 ملليميتر وزراعتها للحصول منها على نبات كامل .
2- الحصول على نباتات خالية من الفيروس فقد تمكن Murashige et al 1968 من الحصول على نباتات خالية من الفيروس من نسيج النيوسلة لبعض النباتات أحادية الأجنة Monoembryonic فى الموالح (الشادوك) وفى تلك الحالة أمكن إنتاج نباتات خالية من الفيروس وفى نفس الوقت مشابهة للأم من حيث الصفات أنها أجنة جسمية.
3- استخدام التطعيم الدقيق نظراً لصعوبة الحصول على نبات كامل من زراعة القمة النامية مباشرة على بيئة غذائية فى بعض النباتات فقد استحدث هذا التكنيك Shoot tip micrografing وذلك بزراعة بذور الأصل فى الظلام ثم عزل القمة النامية بطول 0.14 – 0.18 ملليميتر وتطعيمها على بادرة الأصل وبذلك نحصل على شتلة مكونة من أصل وطعم وخالية من الفيروس بعد عدة أسابيع.

رابعاً: استخدام زراعة الأنسجة كوسيلة سريعة للتكاثر Rapid clonal multiplication
نظراً لأن طريقة التكاثر الخضرى بالوسائل التقليدية ليست سريعة بالدرجة الكافية لمواجهة الطلب المتزايد على النباتات خاصة نباتات الزينة فإن أسعار تلك النباتات فى الزيادة فى جميع بلدان العالم مما دفع الكثير إلى استخدام تكنيك زراعة الأنسجة لتوفير تلك الأعداد من النباتات بسعر مناسب فى حيز محدود. كما نجح إكثار بعض النباتات الصعبة الإكثار والغالية مثل الأوركيد بذلك التكنيك كما أمكن إنتاج أعداد كبيرة من نخيل البلح والذى يمتاز بقلة خروج الفسائل عليه وارتفاع أثمانها .

4- مراحل زراعة الأنسجة
للوصول إلى الأهداف السابقة الذكر فإن هناك ثلاثة مراحل رئيسية للحصول على زراعة ناجحة للأنسجة وهى:

أولاً: الحصول على مزرعة معقمة Stage І : Establishment of a septic culture

هذه المرحلة هامة جداً وتعتبر من أهم مراحل زراعة الأنسجة والغرض منها ببساطة هو الحصول على مزرعة معقمة بمعنى عدم تلوث البيئة الغذائية المستعملة أو الأنسجة المستخدمة فى الزراعة Explants بأى كائن دقيق يسبب تعفنها وموتها . ويأتى ذلك بتعقيم الأدوات المستعملة وتعقيم البيئة المستخدمة وكذلك تعقيم الأنسجة المستعملة والتى تكون عبارة عن أجزاء من النبات المراد إكثاره مثل القمم النامية للسيقان والجذور أو أجزاء من السيقان أو الأوراق أو نسيج الكلس ..............الخ. ثم إتمام الزراعة أيضاً فى جو وحيز معقم.

ثانياً: زيادة الأعضاء المتكاثرة Stage П : Multiplication of propagula
لهدف من تلك المرحلة هو زيادة الأعضاء والتراكيب التى تعطى فى النهاية النبات الكامل لذلك تعتمد تلك الخطوة على زيادة إنتاج الأعضاء العرضية Adventitious organs أو زيادة تكوين الأجنة أو زيادة تنشئة النموات الجانبية Axillary shoots وعندما يكون الكلس خطوة وسطية يكون الهدف فى تلك المرحلة هو زيادة نمو الكلس ثم تخليق النموات العرضية الخضرية منها أو تكوين الأجنة الجسمية Somatic embryo


ثالثاً: الإعداد لنقل النبات للتربة Stage Ш : Preparation of re-establishment of plant
يمكن اعتبار أن التكاثر عن طريق زراعة الأنسجة ناجحاً إذا توج بنجاح نقل النبات الناتج فى الأنبوبة المعقمة إلى التربة واستمرار نموه وللوصول لهذه الغاية يجب العمل على أقلمة أو تقسية النباتات Hardening of plant قبل نقلها للظروف الصعبة المحتمل أن تواجهها فى التربة مثل نقص الرطوبة Stress tolerance to moisture خاصة إذا علمنا أن تلك الأنسجة تعتبرنامية فى وسط مائى Heterotrophic وسوف تنتقل إلى وسط آخر Autotrophic state . كذلك يجب استيفاء تلك النباتات لاحتياجاتها الحرارية أن وجدت لإنهاء طور الراحة كما للأبصال وللكورمات والريزومات احتياجات البرودة Chilling requirement فيجب استيفاءه قبل نقلها للتربة .

o احتياجات كل مرحلة Requirements of each stage :
إحتياجات كل مرحلة تشمل احتياجات غذائية بمكونات البيئة وطبيعتها واحتياجات بيئية أى تعرض الأنسجة لدرجات حرارة وشدة إضاءة معينة. وعند دراسة المرحلة الأولى يجب ألا نغفل أن نجاح التكنيك يعتمد أساساً على حسن اختيار الجزء المنزرع Explants أما المرحلة الثانية فإن نجاحنا يتحدد بمعرفتنا إلى طريقة زيادة الأعضاء العرضية المتكونة مثل النموات العرضية والأجنة الخضرية والنموات الجانبية ..الخ. أما فى المرحلة الثالثة فيجب أن نكون ملمين بالاحتياجات الفسيولوجية للنبات المتكون كاحتياجه مثلاً لكسر طور سكونه إن كان له طور سكون أو احتياجه إلى معاملات خاصة للتقسية مثل تعريضه إلى إضاءة ذات شدة عالية High intensity light .